Ощущение ДНК - Hengyang Laser Welder Group Co., Ltd.

Природная биомедицинская инженерия (2023 г.) Процитировать эту статью

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Количественная оценка одиночной молекулы силы и специфичности последовательности взаимодействий между белками и нуклеиновыми кислотами облегчит исследование связывания белка с ДНК. Здесь мы показываем, что события связывания между каталитически неактивным рибонуклеопротеином Cas9 и любой заранее определенной короткой последовательностью двухцепочечной ДНК могут быть идентифицированы путем измерения изменений ионного тока в виде специально разработанных линейных наноструктур ДНК со штрих-кодом с выступающими выступами двухцепочечной ДНК, связывающимися с Cas9. через твердотельные нанопоры. Мы разработали наноструктуры ДНК со штрих-кодом для изучения взаимосвязи между последовательностью ДНК и специфичностью связывания ДНК, эффективностью связывания ДНК и толерантностью Cas9 к несовпадению ДНК на уровне одного нуклеотида. Обнаружение наноструктур со штрих-кодом ДНК с помощью нанопор может помочь улучшить разработку эффективных и специфичных рибонуклеопротеинов для биомедицинских применений, а также может быть использовано в чувствительных анализах обнаружения белков.

Распознавание последовательностей нуклеиновых кислот белками имеет фундаментальное значение для биологии. Благодаря специфичности связывания белок-ДНК, взаимодействия между этими биомолекулами составляют основу многих инструментов биосенсорства, методов биомолекулярной инженерии и новых методов лечения1,2. В частности, системы кластеризованных коротких палиндромных повторов с регулярными промежутками (CRISPR)/dCas9 стали мощными инструментами для целевой экспрессии генов, а также диагностики, и в настоящее время проводится значительная работа по повышению эффективности и специфичности CRISPR/Cas3,4. Поэтому важно разработать простые и чувствительные методы анализа, которые анализируют взаимодействия между нуклеиновыми кислотами и белками в их свернутом и функциональном состояниях, чтобы выявить их нативное поведение. Кроме того, крайне важно, чтобы эти методологии были чувствительны к различиям в последовательностях отдельных нуклеотидов, которые могут существенно повлиять на связывание.

Резистивное измерение импульсов с помощью твердотельных нанопор является привлекательным методом оценки событий связывания. Этот метод предлагает гибкость для изучения ДНК, РНК и белков в их нативном состоянии с помощью единой сенсорной системы. Зондирование нанопор основано на измерении изменений ионного тока, когда молекулы проходят через нанометровую пору с помощью приложенного электрического поля. Изменение ионного тока в результате события транслокации отражает размер, форму и заряд молекулы5. Существует два типа нанопор: биологические и твердотельные. Хотя белковые нанопоры биологического происхождения идеально подходят для секвенирования ДНК6, твердотельные нанопоры позволяют контролировать размер пор в процессе производства, позволяя обнаруживать широкий спектр аналитов.

Хотя эта универсальность позволяет анализировать множество биомолекул, отсутствие специфичности зондирования также представляет собой проблему для мультиплексного обнаружения, при котором интересующие цели должны быть легко дифференцированы. Чтобы преодолеть этот барьер, мы используем нанотехнологию ДНК, которая позволяет разрабатывать и собирать индивидуальные наноструктуры, содержащие специфические сайты связывания для интересующих белков7.

В этой статье мы создаем твердотельные нанопоры, вытягивая кварцевые капилляры, также известные как нанопипетки, которые будут использоваться в качестве общего инструмента обнаружения. Двухцепочечная ДНК (дцДНК) создает падение ионного тока в сигнале нанопор. При связывании аналита, такого как белок, с дцДНК создаются всплески вторичного тока. Путем создания специфических сайтов связывания или последовательностей вдоль цепи ДНК создается идентифицируемый образец. Этот отпечаток можно наблюдать как уникальную подпись всплесков ионного тока. Мечение и картирование целевых последовательностей нативной ДНК в нанопорах ранее осуществлялось с использованием различных методов, включая пептидные зонды нуклеиновых кислот8,9, биохимическое лигирование10, факторы транскрипции11 и химическую модификацию метилтрансферазой и биотинилирование12. Недавно было продемонстрировано использование анализа нанопор для измерения связывания варианта каталитически неактивного или мертвого Cas9 (dCas9) с дцДНК2,13. Наша система опирается на эти начальные работы по проверке концепции, представляя разработанные наноструктуры ДНК для пользователей. определение целевого тестирования ДНК, что расширяет область применения зондирования нанопор, нанотехнологий ДНК и скрининга взаимодействий белок-ДНК. Здесь мы демонстрируем, что при тщательном проектировании и тестировании комплексы dCas9 могут действовать как метка, позволяющая высокоспецифическое картирование ДНК для определения изменений одной пары оснований, что особенно важно для диагностики4,14.

1016) molecules25. The number of multiplexed protein–DNA interactions is limited only by the number of nanopores and our ability to assemble these DNA nanostructures. In the sensing region of the nanostructure, two oligos were designed to create a dsDNA overhang that is 50 bp in length. This dsDNA overhang can present any DNA sequence of interest including target sequences for dCas9 binding./p> 65 events for each experiment. A control nanostructure with target DNA containing no PAM was also tested as seen in grey, where N > 165. Calculations were made using equations (1) and (2). c, Quantification of labelled events dependent on varying relative concentration ratio of DNA nanostructures (green or purple) in solution with equimolar concentrations of the two dCas9 probes (standard deviation represents one sample measured in at least two different pores). Calculations were made using equations (3–6). N > 85 events for each condition. Error bars represent standard deviation between nanopores. d, Reproduced experiments with 11001 and 11111 nanostructures barcode at a ratio of 2:1 in solution with equimolar concentrations of both dCas9 probes added. The different bars (1, 2 and 3) are three independent sample preparation repeats in three different nanopores. Calculations were made using equations (3–6). N > 100 events for each measurement. In all experiments, dCas9 probes were added in excess to target DNA molecules./p> 45 events for each experiment. Error bars are result of standard deviation from normalization to control binding efficiency./p> 45 events. d, Variations of probe 2 with mutations in gRNA. e, Comparison between predicted efficiency (grey) and measured binding efficiency when mutations are introduced into gRNA. Each experiment has at least greater than N > 55 events. f, Bar graphs with normalized binding ratios depicting probe dependence of GMT and large variation of binding among probes with introduced mutations. Each experiment has at least more than N > 55 events./p>15 pA are discarded. The parameters to find the spikes are based on manual analysis of the threshold, height, distance and prominence parameters from the Python peakfinder package. This is tested on the first ten and last ten events to ensure the parameters are consistent and will accurately find the peaks. Following this, events are sorted on the basis of the number of spikes. Following the sorting, the events are analysed by eye and events that have folds or knots interfering with the barcode are discarded. Our lab has shown that as few as four events are sufficient for positive detection in the majority of cases, while nine correct events increase the probability of positive detection to more than 90% (ref. 46). Percentage of events with dCas9 bound in Figs. 2b and 4 is calculated the following way:/p>